Alat
Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah pewarna metilen blue, crytal violet, nigrosin atau tinta cina, pewarna Gram, ose, bunsen atau lampu spiritus, dan kaca objek.
Bahan
Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah kultur bakteri umur 24 jam.
Cara kerja
Pewarnaan lansung
Air diteteskan pada bagian tengah kaca objek yang bersih dan tidak berlemak. Selanjutnya dengan menggunakan jarum ose yang telah dipijarkan, diambil sedikit bakteri pada biakan bakteri, dicampurkan sedikit dan digeser- geserkan pada air di kaca objek dengan diameter kurang lebih 1 cm sampai rata dan dibiarkan kering di udara atau digoyang – goyangkan diatas api spirtus dengan jarak 30 cm sampai kering. Kemudian diteteskan salah satu zat pewarna ( metilen blue atau crystal violet ) sebanyak 5 tetes dalam sediaan. Sel akan diwarnai metilen blue dalam 30 – 60 detik, sedangkan crytal violet dalam 10 detik. Lalu dicuci kelebihan warna dengan air mengalir. Dikeringkan sediaan dengan meletakkannya diatas kertas saring. Selanjutnya diamati dibawah mikroskop perbesaran 1000X dengan menggunakan minyak immersi. Dicatat dan gambar mikroorganisme yang diamati.
Pewarnaan tak langsung
Diteteskan satu tetes larutan nigrosin di tepi kaca objek yang bersih dari kotoran lemak. Kemudian dicampurkan kultur bakteri dengan menggunakan ose pada larutan tersebut. Diratakan cairan dengan cara diletakkan ujung sebuah kaca objek lain yang bersih ditepi luar dari tetesan diatas kaca objek pada nomor satu diatas. Ditarik kaca objek bagian atas ke arah ujung dari bagian kaca objek yang dibawah sehingga ujung kaca objek bagian atas bergeser sepanjang permukaan kaca objek yang di bawah sehingga cairan menyebar ke seluruh permukaan kaca objek di bagian bawah. Ditunggu kering dan diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000X dengan menggunakan minyak immersi yang selanjutnya digambarkan bentuk dari sel bakteri yang terlihat.
Pewarnaan Gram
Dibersihkan kaca objek dengan alkohol kemudian dikeringkan. Diteteskan 1 tetes air pada kaca objek yang telah dibersihkan. Dipindahkan sedikit biakan bakteri berumur 24 jam dengan menggunakan jarum ose steril pada tetesan air tersebut dan diratakan. Dikeringkan larutan bakteri tersebut di udara, jika terlalu lama, dikeringkan dengan cara dilewatkan bebrapa kali di atas nyala api ( kurang lebih 20 cm ). Setelah kering, dilewatkan geals objek tersebut dengan cepat 2- 3 kali di tengah nyala api supaya lapisan lapisan bakteri terfiksasi dengan baik. Diteteskan kristal violet hingga menutupi hasil fiksasi bakteri. Dibiarkan selama 1 menit, kemudian dibilas dengan air kran. Dicuci lapisan bakteri dengan alkohol selama 10 – 20 detik, kemudian dibilas dengan air kran. Lalu dibubuhi dengan fuchsin basa atau safranin selama 45 detik, selanjutnya dibilas dengan air. Dikeringkan di udara atau digunakan kertas tissue secara hati – hati. Dibubuhi kertas minyak immersi dan diamati bentuk serta warna bakteri pada perbesaran 1000X. Digambarkan bentuk bakteri yang terlihat pada mikroskop. Setelah pengamatan selesai, dibersihkan lensa mikroskop dengan mengunakan xylol.
Pembahasan
Pewarnaan Langsung
Langkah awalnya, disemprot kedua telapak tangan dengan alkohol, tujuaannya supaya tangan dan kaca objek yang akan dipergunakan menjadi steril baik dari bakteri maupun mikroorganisme lain yang menempel. Selanjutnya diteteskan air pada bagian tengah kaca objek yang bersih dan tidak berlemak, tujuan penetesan air ini, untuk memisahkan bakteri pada koloninya / agar bakterinya dapat berpencar sehingga memudahkan dalam pengamatan karena tidak bergerombol.
Selanjutnya dengan menggunakan jarum ose yang telah dipijarkan, diambil sejumlah bakteri pada biakan bakteri. Tujuan pemijaran jarum ose adalah agar tidak terkontaminasi dengan mikroorganisme lain serta untuk memusnahkan kehidupan mikroorganisme yang tersisa pada jarum ose. Lalu dicampurkan sedikit dan geser- geserkan pada air di kaca objek dan dibiarkan kering diudara atau digoyang- goyang di atas api Bunsen dengan jarak 30 cm sampai kering agar lebih cepat proses pengeringan. Tujuan dikeringkan / difikasasi agar bakteri yang menempel pada kaca objek, pada saat sediaan dicuci, maka bakteri akan masih tetap menempel pada kaca objek.
Selanjutnya dengan menggunakan jarum ose yang telah dipijarkan, diambil sejumlah bakteri pada biakan bakteri. Tujuan pemijaran jarum ose adalah agar tidak terkontaminasi dengan mikroorganisme lain serta untuk memusnahkan kehidupan mikroorganisme yang tersisa pada jarum ose. Lalu dicampurkan sedikit dan geser- geserkan pada air di kaca objek dan dibiarkan kering diudara atau digoyang- goyang di atas api Bunsen dengan jarak 30 cm sampai kering agar lebih cepat proses pengeringan. Tujuan dikeringkan / difikasasi agar bakteri yang menempel pada kaca objek, pada saat sediaan dicuci, maka bakteri akan masih tetap menempel pada kaca objek.
Berikutnya setelah kering, kaca objek ditetesi dengan reagen, pada percobaan ini reagen yang digunakan adalah crystal violet. Ditunggu selama 10 detik. Selama waktu 10 detik itu, zat warna akan dapat diserap oleh bakteri. Kemudian dicuci kelebihan warna dengan air mengalir. Yang perlu diperhatikan saat membilas yaitu posisi kaca objek dimiringkan 45 ยบ dan air dialirkan pada bagian ujung ( atas ) kca objek. Hal ini bertujuan untuk mengurangi tekanan air pada bakteri yang telah diwarnai, sehingga zat warna yang larut dalam bilasan air tersebut hanyalah zat warna yang berlebih yang selanjutnya dikeringkan sediaan pada bagian pinggir kaca objek dengan menggunakan kertas saring atau tissue. Langkah berikutnya diamati dibawah mikroskop dengan pembesaran 1000 x dengan mengunakan minyak immersi. Penggunaan minyak immerse bertujuan agar sediaan tampak jelas saat diamati pada mikroskop, karena sifat dari minyak immerse ini adalah untuk memperbesar indeks bias lensa. Setelah itu dicatat dan digambar. Berikut adalah perbandingan gambar berdasarkan literatur dengan gambar pengamatan.
Pewarnaan Gram
Langkah pertama kaca objek dibersihkan dengan alkohol lalu dikeringkan. Tujuan digunakan alkohol ini adalah untuk mensterilkan kaca objek, karena karena alkohol mempunyai sifat mudah menguap sehingga kaca objek yang telah disterilkam dengan alkohol akan mudah kering. Kemudian teteskan air pada kaca objek yang telah dibersihkan. tujuan penetesan air adalah memisahkan bakteri pada koloninya sehingga tidak bergerombol. Lalu dipindahkan sedikit biakan bakteri yang berumur 24 jam dengan menggunakan jarum ose steril pada tetesan air dan diratakan. Jarum ose sebelum digunakan harus dipijarkan terlebih dahulu, yang bertujuan agar tangan dan kaca objek yang akan digunakan menjadi steril dari bakteri atau mikroorganisme lain yang menempel pada jarum ose. Diratakan, hal ini karena antara air dan bakteri harus benar- benar tercampur. Jika tidak diratakan maka bakteri akan tertimbun – timbun ( bergerombol ) sehingga dalam pengamatan tidak akan jelas.
Selanjutnya lapisan bakteri ditetesi dengan iodine ( lugol ) dan dibiarkan selama 1 menit, kemudian dibilas dengan air. Iodin dalam pewarnaan ini berfungsi sebagai penguat warna sehingga warna bakteri akan nampak jelas.dicuci lapisan bakteri dengan alkohol pada gelas kimi 50 ml, kemudian dibilas dengan air kran. Penggunaan alkohol karena akan menghilangkan kompleks kristal – iodin. Lalu bubuhi dengan fuchsin basa atau safranin selama 45 detik, yang selanjutnya dibilas dengan air. Fuchsin akan menyebabkan bakteri berwarna merah karena kompleks XV – 1 telah hilang dan safranin akan mewarnai dinding sel. Keringkan di udara atau lap bagian pinggir kaca objek dengan menggunakan tissue secara hati- hati.
Dibubuhi dengan minyak immerse dan diamati bentuk dan warna bakteri pada perbesaran 1000 x. Fungsi pemberian minyak immerse ini adalah untuk memperbesar indeks bias. Catat dan gambar bentuk bakteri ynag terlihat pada mikroskop.
